細胞色素b5（Cytochrome b5）含量測定試劑盒說書

微量法 100T/96S

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

細胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。細胞色素 P450 和細胞色素b5 是P450 酶系的兩個血紅素蛋白，其比值的變化與 P450 代謝活性密切相關(guān)。

測定原理：

氧化型細胞色素 b5 經(jīng)連二亞硫酸鈉還原后，在 424nm 處有最大吸收峰，通過測定 424nm 和 490nm 處吸光值的差異，即可計算出細胞色素b5 的含量。

細胞色素b5含量測定試劑盒   P450系列

組成：

試劑一：粉劑×2 瓶，4℃保存。臨用前各加 100ml 蒸餾水，充分溶解。

工作液配制：

臨用前配制，戴一次性手套，小心打開試劑三瓶蓋，加試劑二 20ml 充分溶解，4℃避光可保存 1 周。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

普通離心機，超速離心機、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸餾水。

樣品中細胞色素 b5 提取：

1、除去細胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄上清液。

4、待測液：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即待測液，該待測液需當(dāng)天測定。

細胞色素 b5 含量測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min。

2. 工作液置于 25℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3. 空白管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 10 μl 蒸餾水，200μl 工作液，室溫靜置 2 min，424nm 和 490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為A 空白管 1，490nm 處吸光值記為A 空白管 2。△A 空白管= A 空白管 1- A 空白管 2

4. 測定管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 10 μl 待測液，200μl 工作液，室溫靜置 2 min，424nm 和 490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為A 測定管 1，490nm 處吸光值記為A 測定管 2。

△A 測定管= A 測定管 1- A 測定管 2。

注意：只需要做一個空白管。

樣品細胞色素 b5 含量計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

細胞色素b5 含量(nmol/mg prot) = (△A 測定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）

= 122.8×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計算

細胞色素b5 含量（nmol/g 鮮重）= (△A 測定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷W

= 61.4×(△A 測定管-△A 空白管)÷W

ε：還原型細胞色素b5 納摩爾消光系數(shù)，171×10^-6 L/nmol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm； V 反總：反應(yīng)體系總體積，210 μl =2.1×10^-4 L；Cpr：待測液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定；V 樣：加入反應(yīng)體系中待測液體積，10 μl=0.01 ml；V 樣總：待測液總體積，0.5 ml；W：樣品質(zhì)量（g）。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

細胞色素b5 含量(nmol/mg prot) = (△A 測定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）

= 245.6×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計算

細胞色素b5 含量（nmol/g 鮮重）= (△A 測定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷W

= 122.8×(△A 測定管-△A 空白管)÷W

ε：還原型細胞色素b5 納摩爾消光系數(shù)，171×10^-6 L/nmol/cm；d：96 孔板光徑（cm），0.5cm； V 反總：反應(yīng)體系總體積，210 μl =2.1×10^-4 L；Cpr：待測液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定；V 樣：加入反應(yīng)體系中待測液體積，10 μl=0.01 ml；V 樣總：待測液總體積，0.5 ml；W：樣品質(zhì)量（g）。

細胞色素b5含量測定試劑盒   P450系列